1. 為什么要做單細胞RNA測序(ScRNA-seq)?
主要解決的問題主要有兩個：一是異質(zhì)性(heterogeneity)，比如a)鑒定某些因為含量(比例)較低而在常規(guī)RNA測序檢測時被“掩蓋”的細胞亞群;b) 檢測細胞群體中不同的個體細胞：比如表達不同TCR的T細胞，胚胎發(fā)育早期的各個細胞等;c)追蹤某群細胞內(nèi)細胞間的譜系(lineage)或發(fā)育關(guān)系;二是獲得基因表達、剪接等信息以及根據(jù)這些信息構(gòu)建的調(diào)控關(guān)系。
2. 做單細胞測序的基本步驟是什么?
如上圖所示，共分為9個步驟：
1)單細胞分離;
2) 保留mRNA的細胞裂解;
3) mRNA捕獲;
4)RNA反轉(zhuǎn)成cDNA;
5)cDNA擴增;
6)cDNA測序文庫制備;
7)序列文庫混樣(pooling);
8)生物信息學(xué)工具進行質(zhì)控;
9)專業(yè)的工具進行分析和結(jié)果展示;
3. 單細胞測序檢測的樣品類型有哪些?
理論上說，任何的真核細胞都可以進行scRNA-seq檢測。但在實際操作過程中，需要注意的是：1)從組織(特別是實體組織)中獲得細胞的數(shù)量和活性;2) 在獲取過程中人為操作對細胞轉(zhuǎn)錄組的影響，以避免出現(xiàn)人為因素的轉(zhuǎn)錄表達變化。當然從技術(shù)上說，除了分離單個細胞進行檢測外，還可以直接分離細胞核(nuclei)進行測序。
4. 單細胞測序的方法選擇?
總體上有大約20種protocol，各個protocol的比較如下圖所示：
我們可以看到轉(zhuǎn)錄本的長度包括了：全長(Full length)和3’端測序，需要注意的是對于表達量較低的RNA來說更推薦全長測序。其它的信息還包括了測序的平臺(Droplet、Nanowell等)、測序通量(細胞的數(shù)量)、測序深度、反應(yīng)體系和參考文獻等。
另外，在評估技術(shù)差異的時候常用的兩種策略是“Spike-in”和“UMI”，兩者的定義：
Spike-in：A molecule or a set of molecules introduced to the sample in order to calibrate measurements and account for technical variation; commonly used examples include external RNA control consortium (ERCC) controls (Ambion/Thermo Fisher Scientific) and Spike-in RNA variant control mixes (SIRVs, Lexogen);
UMI(Unique molecular identifier) :A variation of barcoding, in which the RNA molecules to be amplified are tagged with random n-mer oligonucleotides. The number of distinct tags is designed to significantly exceed the number of copies of each transcript species to be amplified, resulting in uniquely tagged molecules, and allowing control for amplification biases.
5. 需要測定的細胞數(shù)量以及測序深度該如何確定?
總體上說，大家需要考慮的因素包括研究目的、細胞的異質(zhì)性大小、平臺和價格。一般來說，異質(zhì)性越高，我們需要檢測的細胞亞群比例越低，需要測定的細胞數(shù)量就越多，大家可以類比考慮，比如A袋子有5個紅球、5個藍球組成;B袋子有赤橙黃綠青藍紫7個顏色組成的10個球，其中我們關(guān)心的藍球只有1個，如果我們想抽到籃球，是不是要抽更多次B袋子?
6. 單細胞RNA測序與常規(guī)RNA測序的區(qū)別是什么?
主要有三點：
1) 單細胞測序中某些低風(fēng)度的轉(zhuǎn)錄本不能被檢測到;
2)單細胞測序比常規(guī)測序的會有更高的技術(shù)誤差(包括檢測噪音等);
3)單細胞測序檢測的轉(zhuǎn)錄本量的分布上更加復(fù)雜，一般是符合負二項分布的，但也出現(xiàn)其它的分布，因此在選擇統(tǒng)計方法時一定要特別注意。
7. 單細胞RNA測序的分析該如何做?
這一部分我們下次單獨寫一期文章來介紹。
8. 單細胞RNA測序未來5年的前景如何?
主要包括幾點：
1) 對檢測細胞(樣本)的要求降低：從新鮮細胞到冷凍保存的細胞;
2)性價比的提高：包括了平臺技術(shù)的進步導(dǎo)致價格進一步降低和檢測通量的增加：
3)對低豐度RNA檢測的問題;
4)新的生信工具和軟件的出現(xiàn)：后面我們會為大家介紹一個數(shù)據(jù)庫——SCPortalen，來看別人的單細胞測序技術(shù)數(shù)據(jù)的挖掘使用。
5)與其它技術(shù)的聯(lián)合：比如Crispr;
6)臨床應(yīng)用：按照這篇文章的觀點，單細胞測序往臨床上用的時間點大約在5年。
9. 單細胞RNA測序在病毒學(xué)上的應(yīng)用?
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