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單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)原理
技術(shù)文章 2018-11-20
　　單細(xì)胞測序主要涉及單細(xì)胞基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序兩個(gè)方面，分別針對單細(xì)胞DNA及RNA進(jìn)行序列分析和比較。單細(xì)胞測序一直是科學(xué)家關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)。單細(xì)胞基因組測序目前主要有兩種擴(kuò)增方法：MALBAC方法及MDA方法，而單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組目前主要有三種方法：SMART擴(kuò)增技術(shù)、10×genomics技術(shù)及Andeplete技術(shù)。

　　今天主要和大家聊聊單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。要實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，需要解決2個(gè)難題：

　　1.PCR偏差：單個(gè)細(xì)胞含有約10pg total RNA，而約80%以上信息為rRNA，從單細(xì)胞RNA到文庫意味著核酸的擴(kuò)增量要達(dá)到百萬倍以上。而在這個(gè)高的擴(kuò)增量不引入PCR偏差一直是個(gè)較大的問題。 我們可以想一下，如果兩個(gè)樣本基因表達(dá)量是相同的，但擴(kuò)增效率A是99%，B是97%，在擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)后，兩者在擴(kuò)增后的表達(dá)就有了1.84(0.99^30/0.97^30)倍的差異。而當(dāng)我們分析差異基因的時(shí)候如果選1.5倍作為差異基因的標(biāo)準(zhǔn)，那么本來沒有差異的基因也會出現(xiàn)差異。

　　2.去除rRNA：rRNA(核糖體RNA)在total RNA占比一般在80%以上，如果不加區(qū)分地進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再擴(kuò)增、建庫很可能測序得到的絕大部分序列都是rRNA的序列，但是一般情況下，如果你更關(guān)心mRNA等編碼基因的序列，rRNA序列不能給我們帶來有效的信息，可以說它是無用的。

     下面我們來分別介紹單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的三個(gè)擴(kuò)增技術(shù)：

　　SMART擴(kuò)增技術(shù)：
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)原理

　　SMART擴(kuò)增技術(shù)最核心的技術(shù)，就是設(shè)計(jì)了2個(gè)特殊的引物。再配合用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

　　特殊引物1由中間PolyT序列加上一段通用序列及3’末端兩個(gè)簡并堿基構(gòu)成，但在PolyT的3’端倒數(shù)第二個(gè)堿基是A、C、G而非T的簡并堿基，而倒數(shù)第一個(gè)為簡并堿基，這樣做的好處是讓它正好結(jié)合在mRNA的3’端連到Poly(A)尾巴的這個(gè)連接處，而不會結(jié)合到mRNA的別的地方。這樣就保證了逆轉(zhuǎn)錄的起始位置正好是mRNA的3’端的序列終止位置。MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，這個(gè)酶有個(gè)特點(diǎn)，就是它在轉(zhuǎn)錄到mRNA的5’端末端的時(shí)侯，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，會在新合成的cDNA的3’末端，多加出幾個(gè)C堿基來。

　　特殊引物2由一段通用序列及它的3’端是3個(gè)非脫氧的G堿基構(gòu)成，也就是核糖核酸的、RNA的G堿基，而不是DNA的G堿基，這個(gè)引物可以與剛才新合成的cDNA的3’端的那幾個(gè)C堿基發(fā)生互補(bǔ)雜交，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，然后引導(dǎo)這個(gè)MMLV酶再次發(fā)揮聚合作用，以剛才那條新合成的cDNA為模板，復(fù)制的結(jié)果，就是得到雙鏈的cDNA。

　　這個(gè)雙鏈cDNA，兩端都已經(jīng)接好了我們?nèi)斯ぴO(shè)計(jì)的PCR引物序列，然后，就加入常規(guī)的PCR引物，進(jìn)行常規(guī)的PCR擴(kuò)增，常規(guī)PCR擴(kuò)增，得到大量DNA。然后可以象常規(guī)的DNA建庫那樣，超聲打斷、建庫、上機(jī)測序了。

　　通過SMART技術(shù)得到的主要是mRNA信息，LncRNA信息大部分會丟失，SMART技術(shù)對于RNA的質(zhì)量要求較高，如果RNA出現(xiàn)降解會導(dǎo)致mRNA 5’端信息丟失。通用引物技術(shù)能保證擴(kuò)增的均一性，但PCR引入的突變不能夠分析出來單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序,單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)

　　10×genomics技術(shù)：

　　首先再凝膠微珠上種上特定的DNA片段，DNA片段由三部分組成：Barcode、UMI、PolyT組成。Barcode是16個(gè)堿基的長度。一共有400萬種Barcode，一個(gè)微珠是對應(yīng)于一種Barcode，通過這400萬種Barcode，可以把凝膠微珠給區(qū)分開。UMI是一段隨機(jī)序列，也就是說每一個(gè)DNA分子，都有自己的UMI序列。10個(gè)堿基長的UMI，有100萬種序列的變化(4^10 = 1,048,576)，UMI的作用是為了區(qū)分哪些哪些reads是來自于一個(gè)原始cDNA分子，區(qū)分基因片段重復(fù)還是duplication及區(qū)分是真實(shí)的SNP位點(diǎn)還是PCR產(chǎn)生的突變。

　　通過10×genomics儀器將單個(gè)細(xì)胞與單個(gè)凝膠微珠通過油相混在一起，形成油包水的小微滴，接下來把細(xì)胞膜破掉，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序讓細(xì)胞當(dāng)中的mRNA游離出來。游離出來的mRNA與小液滴中的水相混合，也就是和逆轉(zhuǎn)錄酶、結(jié)合在凝膠微珠上的核酸引物、以及dNTP底物相接觸。

　　接著，發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。mRNA與凝膠微珠上帶標(biāo)簽的DNA分子相結(jié)合，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，逆轉(zhuǎn)錄出cDNA來。把這個(gè)乳濁液當(dāng)中所有的水相抽出來，也就是把所有帶了標(biāo)簽的cDNA分子都抽出來，再把這些cDNA分子都加上接頭，經(jīng)過PCR擴(kuò)增，做成illumina的測序文庫，放到Illumina的測序儀上進(jìn)行測序。測序完成之后，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

　　10×genomics技術(shù)一次可以同時(shí)得到大量大細(xì)胞數(shù)據(jù)，但只能得到mRNA信息，LncRNA大部分信息丟失，UMI技術(shù)能很好去除認(rèn)為分析引入duplication及PCR引入SNP位點(diǎn)。同樣對RNA質(zhì)量要求高，降解同樣會引起5’端信息丟失。

　　Anydeplete 技術(shù)：
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)原理

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)原理
 

　　Anydeplete技術(shù)首先通過隨機(jī)引物進(jìn)行一鏈合成，一鏈合成引入核苷酸類似物，用于酶切打斷，二鏈合成同樣引入核苷酸類似物用于保證鏈特異性。然后兩端加上接頭，接頭一條鏈也帶有核苷酸類似物，用于酶切降解。當(dāng)形成單鏈文庫后，設(shè)計(jì)特異性引物與rRNA形成文庫結(jié)合，一輪退貨延伸，rRNA文庫形成雙鏈結(jié)構(gòu)。Reverse adaptor上帶有特異的酶切位點(diǎn)，當(dāng)形成雙鏈結(jié)構(gòu)酶切位點(diǎn)被識別，切去接頭，這樣rRNA形成的文庫不帶有完整的接頭，而其他文庫帶有完整接頭，通過PCR擴(kuò)增富積既能得到想要的信息，包含mRNA及LncRNA信息。同樣Anydeplete技術(shù)與10×genomics技術(shù)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序一樣，包含分子標(biāo)簽，可分析duplication及PCR產(chǎn)生突變位點(diǎn)。

　　Anydeplete技術(shù)能夠用于降解性樣本，保證5’端及3’端信息的完整，能同時(shí)得到mRNA及LncRNA信息，如果只希望得到mRNA信息，Anydeplete技術(shù)則會引起一部分?jǐn)?shù)據(jù)浪費(fèi)。

　　總結(jié)： SMART技術(shù)可用于單細(xì)胞mRNA測序，對RNA質(zhì)量要求高，RNA降解會引起5’端信息丟失，沒有分子標(biāo)簽功能。 10×genomics技術(shù)可用于單細(xì)胞mRNA測序，對RNA質(zhì)量要求高，RNA降解會引起5’端信息丟失，有分子標(biāo)簽功能。 Anydeplete技術(shù)可用于單細(xì)胞mRNA及LncRNA測序，對RNA質(zhì)量要求不高，可用于降解性樣本單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。
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