由于細(xì)胞是生物學(xué)的基本單位，研究人員正更加努力地嘗試將它們進(jìn)行單個(gè)分離、研究和比較。DNA研究主要涉及的是測(cè)序單細(xì)胞微生物相對(duì)簡(jiǎn)單的基因組；而更大更復(fù)雜的人類細(xì)胞基因組則是一個(gè)更大的挑戰(zhàn)。隨著測(cè)序成本的大幅度下降，破譯來(lái)自單細(xì)胞的30億堿基的基因組并逐個(gè)細(xì)胞比較序列正在變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。
在過(guò)去的幾十年里，研究人員對(duì)于來(lái)自許多物種的成千上萬(wàn)的基因進(jìn)行了測(cè)序。幾乎在所有情況下，破譯的DNA都是從數(shù)百萬(wàn)的細(xì)胞中提取出來(lái)并混合在一起。其結(jié)果是大量的數(shù)據(jù)，但是博德研究所的遺傳學(xué)家Joel Hirschhorn說(shuō)：“當(dāng)你看向的是整個(gè)細(xì)胞群時(shí)，有許多的現(xiàn)象其中包括大量細(xì)胞與細(xì)胞間的變異就會(huì)變得不再明顯。”這有可能會(huì)改變。
在會(huì)上，四個(gè)小組描述了關(guān)于基因組如何生成多樣性和什么導(dǎo)致特異腫瘤耐受治療的新見(jiàn)解——所有的都是來(lái)自單個(gè)人類細(xì)胞DNA測(cè)序的結(jié)果。他們的報(bào)告引發(fā)了科學(xué)家對(duì)單細(xì)胞測(cè)序潛力的興奮。“我們才剛剛開(kāi)始觸及表面。”Hirschhorn說(shuō)。
由于細(xì)胞是生物學(xué)的基本單位，研究人員正更加努力地嘗試將它們進(jìn)行單個(gè)分離、研究和比較（Science, 7 January 2011, p.24）。DNA研究主要涉及的是測(cè)序單細(xì)胞微生物相對(duì)簡(jiǎn)單的基因組；而更大更復(fù)雜的人類細(xì)胞基因組則是一個(gè)更大的挑戰(zhàn)。隨著測(cè)序成本的大幅度下降，破譯來(lái)自單細(xì)胞的30億堿基的基因組并逐個(gè)細(xì)胞比較序列正在變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。
對(duì)于艾伯特·愛(ài)因斯坦醫(yī)學(xué)院的統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)家Adam Auton而言，單細(xì)胞測(cè)序提供了一個(gè)了解重組（細(xì)胞分裂過(guò)程中配對(duì)染色體交換DNA片段的過(guò)程）的窗口。重組通過(guò)將各種版本的基因一起放置在新組合中幫助生成了遺傳多樣性。它也是細(xì)胞剔除異常DNA的一種方法。
研究人員長(zhǎng)期以來(lái)一直在尋求一種途徑來(lái)測(cè)定發(fā)生在人類重組量，他們提出了一些間接的方式在家庭中或在群體中對(duì)其進(jìn)行測(cè)量。“測(cè)序和比較單個(gè)精子細(xì)胞的基因使得直接且更為系統(tǒng)地探究了這一現(xiàn)象。”Auton說(shuō)。
通過(guò)對(duì)單個(gè)精子細(xì)胞測(cè)序，研究人員正在解析重組率
因此，當(dāng)中國(guó)強(qiáng)大的測(cè)序機(jī)構(gòu)北京基因組研究所（Beijing Genomics Insititute）告訴Auton已經(jīng)完成了對(duì)一名50歲年紀(jì)亞洲男性的167個(gè)精子的測(cè)序時(shí)，Auton熱切地想要看到數(shù)據(jù)。他初期的分析突出了分離單細(xì)胞以及可靠地拷貝DNA進(jìn)行測(cè)序是多么的困難。研究人員發(fā)現(xiàn)了若干來(lái)自多種細(xì)胞的DNA序列；然而只有40個(gè)達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)將每個(gè)精子的DNA與來(lái)自血液樣本的DNA進(jìn)行比較，Auton和他的同事們檢測(cè)到了近1000次重組事件，每個(gè)精子細(xì)胞約24.5次，這一數(shù)字與來(lái)自間接方法的預(yù)測(cè)相一致。重組在整個(gè)染色體不均衡發(fā)生，一些“熱點(diǎn)”（hot spot）代表了重組率增高位點(diǎn)。大多數(shù)情況下，Auton發(fā)現(xiàn)的熱點(diǎn)與研究人員在其他研究中看到的相一致。然而在15號(hào)染色體上也有一個(gè)重組波峰，Auton在會(huì)議上報(bào)告說(shuō)。
來(lái)自斯坦福大學(xué)的Stephen Quake一直在利用一種所謂的芯片實(shí)驗(yàn)室（lab on a chip）開(kāi)發(fā)單細(xì)胞技術(shù)。樣本通過(guò)一連串微通道和微閥門(mén)分離單個(gè)細(xì)胞提取出DNA，并拷貝數(shù)千次以獲得足夠的量用于測(cè)序。Quake報(bào)告說(shuō)他已經(jīng)解決了許多技術(shù)問(wèn)題。他在去年完成了第一次的人類單細(xì)胞測(cè)序，現(xiàn)在他正利用這項(xiàng)技術(shù)研究精子細(xì)胞中的重組并分析突變率。
這一微流體設(shè)備分離了單個(gè)細(xì)胞并復(fù)制了它們的DNA
在單細(xì)胞研究的大潮中，新的測(cè)序方法層出不窮。不過(guò)，很少有人對(duì)這些方法進(jìn)行系統(tǒng)的比對(duì)。慕尼黑大學(xué)生物學(xué)家Wolfgang Enard最近領(lǐng)導(dǎo)團(tuán)隊(duì)，在小鼠胚胎干細(xì)胞的基因表達(dá)研究中比較了一些常用的單細(xì)胞測(cè)序方法，包括Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq和Drop-seq。
01-Smart-seq
SMART（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transc ript）是一個(gè)具有里程碑意義的重要技術(shù)。實(shí)際上，能夠從單細(xì)胞生成全長(zhǎng)cDNA的測(cè)序方案并不多，Smart-seq就是其中之一。對(duì)于等位基因特異性表達(dá)或者剪接變體研究來(lái)說(shuō)，覆蓋整個(gè)轉(zhuǎn)錄組是一件非常重要的事情。
Fluidigm C1單細(xì)胞制備系統(tǒng)能夠自動(dòng)完成Smart-seq步驟。你只需要將制備好的細(xì)胞懸液加進(jìn)去，儀器就會(huì)分離并裂解細(xì)胞，把mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后的cDNA可以拿來(lái)測(cè)序，也可以進(jìn)行qPCR檢測(cè)。
在Enard的比較研究中，F(xiàn)luidigm C1系統(tǒng)的Smart-seq最為靈敏，成本也最高。這一系統(tǒng)使用的微流體芯片不能重復(fù)使用，不過(guò)這種芯片可以放到顯微鏡下觀察，證實(shí)健康單細(xì)胞的存在。
02-CEL-seq
CEL-seq（Cell ex pression by linear amplification and sequencing）是一種采用線性擴(kuò)增的常用測(cè)序方法。線性擴(kuò)增的主要優(yōu)勢(shì)是錯(cuò)誤率比較低，不過(guò)線性擴(kuò)增和PCR都存在序列依賴性偏好。
CEL-seq技術(shù)發(fā)表于2012年，主要是分離單細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄帶有poly-A 尾巴的mRNA片段，給它們貼上代表其細(xì)胞來(lái)源的條碼。2014年Science雜志發(fā)布的MARS-seq與CEL-seq很類似。
CEL-seq和其他線性擴(kuò)增方法生成文庫(kù)花費(fèi)的時(shí)間要稍微長(zhǎng)一點(diǎn)。不過(guò)，CEL-seq在早期階段就給樣本貼上條碼并進(jìn)行混合，大大減少了手動(dòng)操作的時(shí)間。PCR是在最后階段使用的，主要是為了連接正確的測(cè)序接頭，CEL-seq開(kāi)發(fā)者紐約大學(xué)的Itai Yanai介紹到。
CEL-seq所需試劑都是現(xiàn)成的，大約兩天時(shí)間生成測(cè)序文庫(kù)和測(cè)序數(shù)據(jù)，Yanai指出。需要注意的是，CEL-seq與大多數(shù)方案一樣，測(cè)序轉(zhuǎn)錄本的3’端。Enard等人并沒(méi)有親自嘗試著一技術(shù)，只是在比較研究中用到了CEL-seq數(shù)據(jù)。從這項(xiàng)研究來(lái)看，CEL-seq的重現(xiàn)性最好。
GitHub網(wǎng)站提供有CEL-seq可用的生物信息學(xué)工具。Yanai研究團(tuán)隊(duì)正在開(kāi)發(fā)新版本CEL-seq2，新版本的靈敏度將比舊版本高三倍。
03-SCRB-seq
Broad研究所開(kāi)發(fā)的SCRB-seq（single-cell RNA barcoding and sequencing）技術(shù)采用的是PCR擴(kuò)增。該技術(shù)需要結(jié)合流式細(xì)胞儀（FACS）或者其他細(xì)胞分選方法，把單細(xì)胞分配到微孔里去。
SCRB-seq與Smart-seq比較相似，只不過(guò)SCRB-seq會(huì)整合特異性的細(xì)胞條碼，以分辨擴(kuò)增分子的來(lái)源，更準(zhǔn)確的定量轉(zhuǎn)錄本。此外，SCRB-seq并不生成全長(zhǎng)cDNA，而是像CEL-seq一樣富集RNA 3’端。
2014年，開(kāi)發(fā)者們將SCRB-seq技術(shù)提前發(fā)布在BioRXiv上。隨后他們對(duì)這一技術(shù)進(jìn)行了更新，并將其更名為“high-throughput eukaryote 3’ digital gene ex pression”。Broad研究所仍提供有SCRB-seq技術(shù)服務(wù)，SCRB-seq也被整合到了Wafer GenBio systems公司的scRNA-seq平臺(tái)上。據(jù)說(shuō)Fluidigm公司的C1系統(tǒng)很快也將支持SCRB-seq方案。SCRB-seq目前是Enard最中意的測(cè)序方法，它不僅適用于單細(xì)胞RNA測(cè)序，還能支持大量細(xì)胞（bulk）的RNA測(cè)序。可惜的是SCRB-seq并不好DIY，研究者自己很難將測(cè)序流程與FACS對(duì)接起來(lái)。
04-DROP-seq和inDROP
哈佛醫(yī)學(xué)院的研究人員開(kāi)發(fā)了以微滴為基礎(chǔ)的兩種獨(dú)立技術(shù)Drop-seq和inDrop。他們利用微流體裝置將帶有條碼的微珠和細(xì)胞一起裝入微小的液滴，建立了快速、廉價(jià)、高通量的單細(xì)胞RNA-seq方法。這兩種技術(shù)將細(xì)胞隔離在微小的液滴中，裝上用于擴(kuò)增的條碼引物，由此檢測(cè)數(shù)以千計(jì)的細(xì)胞。研究者們認(rèn)為，Drop-seq和inDrop能夠幫助生物學(xué)家進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和分類人體細(xì)胞，繪制大腦等復(fù)雜組織的細(xì)胞多樣性圖譜，更好地了解干細(xì)胞分化，獲得更多疾病的遺傳學(xué)信息。
Enard及其同事發(fā)現(xiàn)，Drop-seq在單個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)的基因數(shù)還不到Smart-seq/C1、CEL-seq和SCRB-seq的一半。不過(guò)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)水平上研究差異性表達(dá)的時(shí)候，高通量Drop-seq和SCRB-seq是最劃算的。哈佛醫(yī)學(xué)院Steve McCarroll實(shí)驗(yàn)室去年下半年根據(jù)用戶反饋，在自己網(wǎng)站上公布了3.1版的Drop-seq（mccarrolllab.com/dropseq）。
參與開(kāi)發(fā)SCRB-seq的Stefan Semrau正在搭建自己的Drop-seq平臺(tái)。Semrau從Whitehead生物醫(yī)學(xué)研究所搬到Leiden物理研究所的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)自己用FACS已經(jīng)不那么方便了，于是他為新實(shí)驗(yàn)室選擇了Drop-seq。建立微流體芯片和液滴系統(tǒng)是整個(gè)過(guò)程中最艱難的部分，不過(guò)Semrau實(shí)驗(yàn)室的一名微流體博士后僅用三周就搞定了這些問(wèn)題。Drop-seq文庫(kù)制備是任何分子生物學(xué)研究者都熟悉的標(biāo)準(zhǔn)操作。據(jù)Semrau估計(jì)，搭建和優(yōu)化Drop-seq大概只需要六個(gè)月時(shí)間。
05-scMT-seq
加州大學(xué)范國(guó)平教授和同濟(jì)大學(xué)薛志剛教授在5月5日的Genome Biology雜志上發(fā)布了自己開(kāi)發(fā)的新測(cè)序方法——scMT-seq。這種方法能夠同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和甲基化組。
研究人員用這種方法對(duì)感覺(jué)神經(jīng)元進(jìn)行研究，揭示了細(xì)胞間的轉(zhuǎn)錄組和甲基化組異質(zhì)性。不過(guò)，這些差異大多不是啟動(dòng)子甲基化造成的。舉例來(lái)說(shuō)，啟動(dòng)子帶CpG島的基因，表達(dá)水平與基因體甲基化正相關(guān)。這項(xiàng)研究表明，scMT-seq可以用來(lái)檢測(cè)單細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組、甲基化組和單核苷酸多態(tài)性信息，進(jìn)而解析表觀遺傳學(xué)基因調(diào)控機(jī)制。
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