黄色精品网站,中文字幕丰满乱孑伦无码专区 ,天天综合网久久综合免费人成,久久国产一区二区三区

新聞中心
企業(yè)新聞 行業(yè)新聞 技術文章
行業(yè)新聞
RNA-seq單細胞轉錄組測序在眼科領域中的研究應用
行業(yè)新聞 2018-11-13
　　細胞作為生命結構的基本單位，儲存大量的生物信息。細胞異質(zhì)性是生物組織的普遍特征，即使是相同類型的細胞受到周圍微環(huán)境的影響也會存在基因表達的差異。細胞的發(fā)育是一個動態(tài)過程，處于不同階段的同一細胞基因表達不同。以往的轉錄組測序技術(bulk RNA-sequencing，bulk RNA-seq)[3]需要對成千乃至上百萬的細胞大樣本進行分析，是對大量細胞測序分析得出的平均結果，或者反映的是數(shù)量占優(yōu)勢的細胞數(shù)據(jù)，這就會掩蓋部分重要信息，忽略細胞之間或細胞亞型之間的異質(zhì)性，不利于生物多樣性的理解和研究。而對于干細胞、腫瘤細胞這類稀有細胞則因樣本量較少，無法作出準確的數(shù)據(jù)分析。為了解單細胞異質(zhì)性，近年來興起的單細胞轉錄組測序技術(single-cell RNA-sequencing，sc RNA-seq)備受關注。

　　sc RNA-seq是從單個細胞水平獲得全轉錄組的表達譜，其原理是將分離的單個細胞的微量全轉錄組RNA擴增后進行高通量測序。2009年，Tang等[4]首次將該技術應用于單個小鼠的卵裂球的基因分析中，最終發(fā)現(xiàn)了芯片未檢測到的5200多個基因和1800個可變剪切點。單細胞測序文庫構建流程主要包括單細胞提取、細胞裂解、mRNA 反轉錄、cDNA 擴增及文庫構建等。本文將對sc RNA-seq過程中的幾項基本技術特征進行分析，并闡述該技術在眼科研究領域中的應用。1sc RNA-seq的基本技術特征

   1.1單細胞分離技術　

       目前，常用的單細胞分離技術主要包括顯微操作(micromanipulation)、激光捕獲顯微切割(laser-capture microdissection，LCM)、熒光激活細胞分選(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)和微流控技術(microfluidics)等。因各項技術的靈敏度和產(chǎn)出率不同，應用范圍亦有所不同。顯微操作技術和LCM是依賴人工在高倍顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)和顏色特征來挑取單個細胞的方法，常用于從培養(yǎng)的細胞系、早期的胚胎細胞和固定組織切片中提取單個細胞。這兩種方法要求操作者技術熟練，難度較大，耗時較長，產(chǎn)出率較低。FACS有20種不同的參數(shù)設置，可依據(jù)細胞大小和形態(tài)，或預先用熒光標記的抗體識別細胞表面標記物，通過流式細胞儀分選出目的細胞。FACS具有全自動和高通量的特點，但是該項技術需要細胞初始樣本量較大，對于一些稀有細胞群體并不適用。微流控技術是在微米級通道中分離、捕獲單個細胞，可以用于稀有細胞的篩選，該方法反應體系小、樣本需求量小、節(jié)約試劑、減少污染，因此，微流控技術被認為是目前單細胞分離最好方法。

單細胞轉錄組測序在眼科領域中的研究應用講解_RNA-seq

　　1.2　單細胞轉錄組的擴增及測序文庫的構建　

       單細胞轉錄組的擴增是sc RNA-seq的關鍵步驟。根據(jù)合成第二條cDNA 鏈時使用的酶，可將單細胞轉錄組測序的cDNA 擴增方法分為PCR 法(如mRNA-Seq、Smart-Seq、Smart-Seq2、STRT-Seq和SMA)、體外轉錄法(如CEL-Seq) 和Phi29 聚合酶法(如PMA)。近年來，芯片液滴法作為新一代的文庫構建方法，具有其獨特的優(yōu)勢。

　　Islam等[11]發(fā)明的CytoSeq技術是將細胞懸液加入微反應孔中進行基因分析，用于研究細胞表達的差異，檢測罕見細胞類型，該方法不受細胞體積的限制，可直接對不同大小和性狀的混合細胞群進行研究。但該技術目前只能用于已知基因的研究，不能發(fā)現(xiàn)新基因。Drop-Seq[12]和inDrops[13]是將細胞懸液封裝在含有DNA啟動子條形碼的水凝膠球的液滴中，然后細胞溶解，經(jīng)反轉錄過程，mRNA被條形碼標記?？勺粉櫭總€基因的細胞來源，顯著提高了測序通量并降低了測序成本。液滴微流控平臺可同時捕獲上千個單細胞，并對其轉錄組或基因組進行測序，具有反應試劑少、效率高等特點。目前，許多平臺已經(jīng)商業(yè)化，并向研究人員提供單細胞轉錄組測序服務。Illumina是一個大量平行短序列測序平臺[14]，可同時對8個樣本進行分析，細胞通量大，測序效率高，但儀器設備昂貴。

        ChromiumTM Single Cell 3′Solution平臺是10x Genomics公司研發(fā)的一種直接的、低成本的測序方法，一次可封裝8個樣本，耗時約6 min，細胞捕獲效率近50%。利用一種新的簡易算法“Supernova”，每次計算僅需2 d時間，大大提升了檢測效率。目前已廣泛應用于臨床多個領域。ICELL8(WaferGen Biosystems)是一種新的單細胞RNA測序系統(tǒng)，芯片含有5184個反應孔，每個反應孔均填充有寡核苷酸編碼的poly-d(T)、獨特的條碼和單一分子識別符，可捕獲約1300個單個細胞。

         該系統(tǒng)具有一個多樣本納米級分配器 Multi-Sample Nano-Dispenser (MSND)，與顯微鏡連接，可在數(shù)分鐘內(nèi)對所有的反應孔進行觀察，大約可以有37%的反應孔捕獲單個細胞，MSND可以僅向含有單個細胞的反應孔中填加反應物，很大程度上節(jié)省了時間和費用。該系統(tǒng)可以從復雜樣本中分離單個細胞，是一個高效經(jīng)濟的單細胞轉錄組測序方法，能夠完成上千個細胞的表達譜分析，使得研究人員能夠?qū)碗s的生物樣本細胞轉錄組進行破譯，具有細胞重復率低、交叉污染少、純度高等特點。Fluidigm公司研發(fā)的C1 單細胞擴增儀器[21]，可以在同一芯片上自動完成Smart-seq步驟，將單細胞分離、反轉錄及cDNA擴增，構建cDNA文庫，即可進行二代測序(next generation sequencing，NGS)或qPCR，顯著提高了測序效率，省時省力。但是這些方法需要特殊儀器，耗資巨大。

         而改良的Smart-seq2方法，可以同時對上百個細胞的轉錄組進行測序，不需要試劑盒或特殊的單細胞捕獲工具。Gardeux的研究團隊等開發(fā)了一個針對sc RNA-seq數(shù)據(jù)的完整分析的網(wǎng)絡平臺，即自動化單細胞分析途徑(automated single-cell analysis pipeline，ASAP)，運用這一平臺，科研人員不需要具備強大的計算機技術和知識儲備，僅使用各種常用的算法和工具來分析sc RNA-seq的數(shù)據(jù)。這為人們分析細胞多樣性和異質(zhì)性提供了有效的工具。Hu等在論文中描述了一種新的方法，即用機器學習算法[如support vector machine (SVM) 和random forest (RF)]分析sc RNA-seq數(shù)據(jù)。這是一種鑒別不同細胞中轉錄組數(shù)據(jù)差異的最佳方法，還可以擴展并適用于其他單細胞轉錄組測序表達譜的研究，如高度異質(zhì)性腫瘤的進展和治療。許多生物信息學工具是專門設計用于單細胞測序的數(shù)據(jù)分析，在干細胞領域被用來區(qū)分細胞類型及細胞亞型，確定標記基因。Monocle是最近發(fā)明的一種針對sc RNA-seq數(shù)據(jù)的無監(jiān)督算法，通過對數(shù)據(jù)空間降維形成一個偽時間軌跡，對細胞發(fā)育和分化的進程進行時間序列重構。這種序列重排揭示了關鍵調(diào)控因子表達的閘門式變化，發(fā)現(xiàn)新型的細胞分化的調(diào)控因子。這項研究表明，用Monocle進行單細胞表達分析，揭示監(jiān)管分化的新調(diào)控作用。


RNA-seq單細胞轉錄組測序在眼科領域中的研究應用
　　1.3　sc RNA-seq的應用　細胞是生物體的基本結構單位和功能單位，在其生長發(fā)育過程中，因細胞狀態(tài)、環(huán)境刺激因素和內(nèi)在程序的不同，轉錄組信息的變化呈多樣性表現(xiàn)，這種多樣性是構成細胞異質(zhì)性的關鍵因素。

        sc RNA-seq能夠從單個細胞水平研究RNA的差異表達。自2009年，Tang等首次應用sc RNA-seq以來，這項技術已發(fā)展成為研究復雜生物體系細胞異質(zhì)性的有效方法，被更多的研究人員應用于多個研究領域，包括干細胞發(fā)育和分化、胚胎期器官的發(fā)育、腫瘤、免疫、神經(jīng)以及微生物等。
        下面將對近年來該技術在眼科研究領域的應用進行綜述。

       2sc RNA-seq在眼科研究領域的應用

       2.1sc RNA-seq在眼部細胞亞型及罕見細胞類型鑒定中的應用　

       神經(jīng)系統(tǒng)是由多種細胞組成，僅與視覺相關的成年小鼠大腦視皮層就含有上百萬個細胞。精確的細胞分類有助于科學家對大腦的發(fā)育、功能以及疾病狀態(tài)等方面進行研究。近年來，根據(jù)sc RNA-seq在大腦皮層、下丘腦以及感覺神經(jīng)元等方面研究的應用，將細胞按基因表達特征進行分類，使人們對神經(jīng)多樣性的理解更加深入。

        視網(wǎng)膜屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，含有60余種神經(jīng)元，在視覺圖像產(chǎn)生過程中起特定的作用。視覺圖像的產(chǎn)生包括3個階段，首先平行光線被光感受器細胞捕獲，將光信號轉變?yōu)殡娦盘枺缓蠼?jīng)雙極細胞傳導至特定的神經(jīng)節(jié)細胞形成神經(jīng)沖動，最后經(jīng)視神經(jīng)傳入大腦視覺中樞。視網(wǎng)膜是一種易于觀察、易于獲取的組織，又具有一定的神經(jīng)元多樣性，是研究細胞發(fā)育、神經(jīng)元分化以及神經(jīng)系統(tǒng)多樣性的完美模型，它由多種細胞類型組成，包括神經(jīng)節(jié)細胞、小膠質(zhì)細胞、無長突細胞、雙極細胞、光感受器細胞以及視網(wǎng)膜色素上皮細胞等。對于如此復雜的組織結構，應用傳統(tǒng)的大量細胞基因測序(bulk RNA-seq)，將不能準確反映細胞之間的特異性。而sc RNA-seq則能夠精確反映單個視網(wǎng)膜細胞的基因表達情況。

         Goetz等在JoVE中闡述了單個視網(wǎng)膜細胞轉錄組基因表達分析的實驗步驟。Laboissonniere等應用視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞亞型進行分類，目的是將細胞的基因表達特征與其功能和形態(tài)學特征聯(lián)系起來。為確保這種分類方法分離出的細胞亞型具有相同的功能，他們提出在細胞分離和測序之前先確認它的形態(tài)和功能，使得細胞亞型標記物的識別更容易，分類更準確。Shekhar等用GFP轉染雙極細胞和Müller膠質(zhì)細胞，F(xiàn)ACS收集GFP陽性細胞，應用大規(guī)模平行單細胞轉錄組測序技術(Drop-seq)對約25 000個小鼠視網(wǎng)膜雙極細胞進行分類，獲得了15個細胞亞型。同時利用分子表達與細胞形態(tài)相匹配的方法驗證了這種分類方法的準確性，并鑒定了數(shù)十種新的遺傳標記物。單個視網(wǎng)膜亞型細胞遺傳標記物的鑒定，有助于研究和繪制與特定視功能相關的靶點，使人們更深入地了解細胞功能及細胞異質(zhì)性的來源，探究維持細胞多樣性的基因網(wǎng)絡。

　　另外，sc RNA-seq可用于罕見細胞類型的鑒別，如干細胞、前體細胞、腫瘤干細胞及循環(huán)腫瘤細胞等，以利于深入理解這些稀有細胞種群的生物學功能和特征。Kameishi等[40]發(fā)現(xiàn)兔角膜緣上皮旁群細胞與非旁群細胞相比具有干細胞樣表型，應用GO(gene ontology)分析和RNA測序表明角膜緣上皮旁群細胞的間充質(zhì)/內(nèi)皮細胞標記物的表達較上皮細胞標記物顯著增強，另外，單細胞qRT-PCR顯示角膜緣上皮旁群細胞至少含有2種未成熟的細胞群，具有內(nèi)皮樣或間充質(zhì)樣表型，提示在角膜緣存在一種新型的角膜上皮干細胞，與傳統(tǒng)的角膜上皮干細胞不同。目前，角膜緣上皮旁群細胞的研究促進了角膜上皮再生醫(yī)學的進展，通過單細胞轉錄組的分析不僅僅鑒定了新的角膜上皮干細胞，同時也可以更好地理解干細胞或前體細胞在體內(nèi)組織損傷修復過程中的作用。

　　2.2　sc RNA-seq對年齡相關性黃斑變性發(fā)病機制及治療的研究　視網(wǎng)膜退行性病變，如視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)、年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)，以光感受器細胞進行性損傷為特征，是發(fā)達國家視力喪失的主要原因[41]。先前關于AMD的遺傳學研究認為可能的危險因素包括基因遺傳、紫外線暴露、飲食習慣、心血管疾病、吸煙、飲酒等，其中基因遺傳因素起非常重要的作用[42]。隨著sc RNA-seq等基因組技術的研究進展，科學家將基因與發(fā)病機制相聯(lián)系，進一步明確該疾病的發(fā)病機制。

RNA-seq單細胞轉錄組測序在眼科領域中的研究應用
 
       Radeke的研究團隊對68例捐獻的眼組織進行單細胞轉錄組測序基因比較，其中包括31例正常眼，26例已確診為AMD，11例被認為具有發(fā)展成為AMD的高危因素。研究發(fā)現(xiàn)50余個基因在AMD 細胞中高表達，其中前20個基因能夠?qū)MD的診斷進行預測。在對RPE/脈絡膜層的轉錄因子檢測中，他們發(fā)現(xiàn)與凋亡相關的轉錄因子在干性AMD患者中呈高表達，而與血管生成相關的轉錄因子在濕性AMD患者中呈高表達。另外，他們還發(fā)現(xiàn)細胞介導的免疫反應是所有類型AMD的核心特征，由此推斷AMD可能是一類具有共同的免疫反應過程的單一疾病。根據(jù)這些結果，針對核心免疫過程的藥物可能成為AMD治療的靶向藥物。Morgan 等應用基因組技術比較了健康者和AMD患者的外周血及眼組織中基因表達和信號通路的不同，確定了特定危險基因與該疾病的關系，為實現(xiàn)特異性的靶點治療提供科學依據(jù)。

　　2.3　sc RNA-seq對干細胞移植治療視網(wǎng)膜退行性病變后基因單細胞轉錄組測序變化的評估　視網(wǎng)膜退行性病變尚無有效的治療方法，干細胞或前體細胞移植是目前實驗研究中最具潛能的治療方法，可能終止或延緩視力喪失的進程。隨著干細胞移植在視網(wǎng)膜退行性病變治療方面研究的不斷進展，其基因表達變化的分子機制需進一步研究。
               Jones 等將人腦源性神經(jīng)前體細胞(human neural progenitor cells，hNPC)移植到RCS (royal college of surgeons)視網(wǎng)膜退行性病變大鼠視網(wǎng)膜下，通過轉錄組測序分析獲得實驗組和對照組的視網(wǎng)膜中RNA數(shù)據(jù)，與假手術組RCS大鼠和 LE (long evans)大鼠對照。分析得出RCSsham 與LEsham有1215個基因差異性表達，RCShNPCs與 RCSsham 有283個基因差異性表達，比較這2組基因，發(fā)現(xiàn)68個逆表達基因(稱為救援基因)，包括Pdc、Rp1和 Cdc42ep5。該單細胞轉錄組測序研究結果為研究hNPC移植治療視網(wǎng)膜退行性病變后的基因表達變化提供依據(jù)。在將來的干細胞移植治療視網(wǎng)膜退行性病變的研究中，sc RNA-seq可用于增強或預測治療的反應。

　　2.4　sc RNA-seq在眼部腫瘤的靶向治療研究中的應用。
        眾所周知，腫瘤的分子特征和細胞特征可提示腫瘤細胞的來源，為靶向治療提供依據(jù)。視網(wǎng)膜母細胞瘤是一種嬰幼兒常見的眼內(nèi)惡性腫瘤。1897年Wintersteiner曾嘗試將視網(wǎng)膜母細胞瘤的細胞特征與特異性的視網(wǎng)膜細胞類型聯(lián)系起來，認為光感受器細胞可能是腫瘤細胞的來源。還有人則認為其來源于前體細胞、膠質(zhì)細胞或無長突細胞。關于腫瘤細胞的來源問題引起的爭論大約持續(xù)了一個世紀。

        如今，Mcevoy等對視網(wǎng)膜母細胞瘤患者及小鼠模型的腫瘤細胞進行單細胞基因表達陣列分析，顯示在單一視網(wǎng)膜母細胞瘤的細胞中存在多種細胞類型特異性表達，主要包括光感受器細胞、視網(wǎng)膜前體細胞和含有無長突細胞與水平細胞的中間神經(jīng)元，這種現(xiàn)象在正常視網(wǎng)膜發(fā)育過程中是不存在的，說明在腫瘤的發(fā)生過程中，控制視網(wǎng)膜發(fā)育和構建不同細胞類型的信號通路受到干擾。該研究指出從單細胞水平綜合分析腫瘤的分子、細胞及生理學特征，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)受體、轉運蛋白和生物合成酶在人視網(wǎng)膜母細胞瘤中表達，干擾這些通路可以減少腫瘤在體內(nèi)外的生長。靶向神經(jīng)遞質(zhì)兒茶酚胺和吲哚胺受體或下游成分在未來的單細胞轉錄組測序研究中可能成為視網(wǎng)膜母細胞瘤治療的新靶點。

RNA-seq單細胞轉錄組測序在眼科領域中的研究應用

　　2.5　sc RNA-seq在眼外傷引起的基因表達變化中的應用　眼球爆炸傷在嚴重損壞視功能的同時還會發(fā)生基因的改變。Struebing等利用50 psi(1 psi=6.895 kPa)的高壓空氣波致54只小鼠眼球爆炸傷，5 d 后對視網(wǎng)膜RNA表達進行分析，約40%基因表達發(fā)生變化。通過機器學習算法，發(fā)現(xiàn)與天然免疫和獲得性免疫相關的基因網(wǎng)絡活化，伴隨淋巴細胞入侵到視網(wǎng)膜內(nèi)層，爆炸損傷還會引起視功能和神經(jīng)節(jié)細胞的進行性喪失。

       3總結與展望 隨著分子生物學和生物信息學的不斷發(fā)展，sc RNA-seq從技術和設備等多方面不斷優(yōu)化，涌現(xiàn)出一系列的商業(yè)化的測序平臺，具有單次樣本量大、耗時短、費用低、通量高等特點。sc RNA-seq可以從單個細胞的分子水平獲得全基因組的表達譜，深入了解細胞個體間的差異，已廣泛應用于干細胞的分化、胚胎及器官的發(fā)育、腫瘤的發(fā)生發(fā)展、神經(jīng)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)等多個研究領域，并取得長足的進步。近年來，該單細胞轉錄組測序技術在眼科研究領域的應用也日漸增多。

        sc RNA-seq可鑒別眼部細胞類型特異性標記物，有助于發(fā)現(xiàn)新的罕見細胞類型及細胞亞型，深入了解細胞間的個體差異。應用該技術分析AMD的發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)新的生物靶點和標記物，可能作為視網(wǎng)膜退行性疾病治療的新方法。比較干細胞移植治療視網(wǎng)膜退行性病變前后的基因表達變化，可用于增強或預測治療的反應。通過該技術發(fā)現(xiàn)特異性標記物，可追溯視網(wǎng)膜母細胞瘤的腫瘤細胞來源，闡述腫瘤的發(fā)病機制，揭示腫瘤細胞的異質(zhì)性，為腫瘤的預后評估及個體化治療提供依據(jù)。sc RNA-seq與生物信息學技術的緊密結合，可為揭示細胞發(fā)育和分化過程中的基因調(diào)控網(wǎng)絡提供強有力的檢測方法。
         目前，sc RNA-seq在眼科研究領域的應用仍較局限，隨著該單細胞轉錄組測序技術的不斷進步，在未來數(shù)年中可能迅速擴展到眼部相關疾病的研究中，如評估干細胞或前體細胞向眼組織的分化過程中的基因表達變化;探索干細胞眼內(nèi)移植引起免疫排斥反應的發(fā)生機制;研究各種眼部腫瘤的發(fā)病機制、個體化治療和預后的評估等。該技術將逐漸應用于臨床，指導疾病診斷及治療。
免責聲明：部分圖片來源于網(wǎng)絡，如有侵權請聯(lián)系刪除！